Brza i napredna metoda za analizu većih nukleinskih kiselina pomoću slalom kromatografije

mRNA terapeutici predstavljaju raznovrstan portfelj za razvoj cjepiva i imunoterapija u području raka, kao i terapija „zamjene proteina“ (protein replacement terapije). Ključni korak u sintezi mRNA jest in vitro transkripcija (IVT), proces kojim se iz DNK molekule formira jednolančana mRNA. Iako je enzimski IVT proces učinkovit, on dovodi do nastanka dvolančane RNK (dsRNA). Ona predstavlja neželjeni nusproizvod, odnosno kontaminant, koji ugrožava sigurnost i učinkovitost konačnog proizvoda. Terapija koja sadrži ovakav kontaminant može izazvati neželjenu aktivaciju imunološkog sustava, čak i kada je prisutan u vrlo niskim koncentracijama.

Zbog toga je izuzetno važno da se u laboratorijskim analizama koriste tehnike visoke osjetljivosti koje mogu detektirati nukleinske kiseline, ali i kontaminante u malim koncentracijama.

Određivanje nukleinskih kiselina pomoću gel-elektroforeze rutinska je metoda, ali rezultat analize često nije dovoljno osjetljiv za detekciju niskih koncentracija ometajućih komponenti. S druge strane, ako se uzorci analiziraju osjetljivom metodom poput ELISA-e, koja se temelji na detekciji dsRNA-specifičnih antitijela, analiza zahtijeva više vremena jer uključuje veći broj koraka.

Problem nastaje kada je potrebno analizirati velik broj uzoraka u kratkom vremenskom razdoblju, što može dovesti do neželjenih pogrešaka. Također, dot-blot metoda je vremenski zahtjevna i nedovoljno pouzdana jer može doći do lažno pozitivnih rezultata uslijed nespecifične adsorpcije na membranu. U takvim slučajevima analizu je potrebno ponoviti, što u laboratoriju dovodi do dodatnog vremenskog opterećenja i povećane potrošnje laboratorijskog materijala. Zbog tih nedostataka, tvrtka Waters razvila je alternativu agaroznoj gel-elektroforezi i kapilarnoj gel-elektroforezi, koje se koriste u praksi, s ciljem povećanja pouzdanosti i ponovljivosti analize većih molekula nukleinskih kiselina pomoću HPLC sustava.

Što je slalom kromatografija?

Slalom kromatografija prvi je put primijenjena 1988. godine za analizu dvolančanih DNK molekula, no zbog tadašnjih izazova, poput loše čistoće čestica, velikih gubitaka uzorka i slabe retencije, nije se dalje razvijala sve do danas. S brzim razvojem staničnih linija, genske terapije i bioinertne ultra-visokotlačne tekućinske kromatografije (UHPLC), slalom kromatografija ponovno doživljava procvat.

Koja je analitička oprema potrebna za slalom kromatografiju?

Za slalom kromatografiju potreban je UHPLC ili UPLC sustav, kao i odgovarajuća kolona „GTxResolve Slalom“, posebno dizajnirana za ovu vrstu analize, jer mora izdržati visoke tlakove i velike protoke pri kojima se analiza provodi.

S obzirom na to da se slalom kromatografijom analiziraju nukleinske kiseline koje sadrže komponente osjetljive na metal, tvrtka Waters razvila je rješenje koje smanjuje adsorpciju komponenti iz uzorka na metalne ione kućišta kolone. To je rješenje ostvareno u obliku „Hydrophilic High Performance Surface – HPS“ slalom kolona, kao i sustava Arc Premier (UHPLC), Acquity Premier (UPLC) i Alliance iS Bio, kod kojih su sve kapilare izrađene primjenom HPS tehnologije.
Razlog tome je što biomolekule dolaze u kontakt s metalom kroz cijeli sustav, a ne samo u koloni. Na taj se način postiže znatno veća osjetljivost analize u usporedbi s uporabom samo bioinertne kolone u neinertnom sustavu. Također, sva tri sustava prikladna su za rad pri dovoljno visokim tlakovima, koji su ključni za slalom kromatografiju (> >9500 psi).

Kako funkcionira slalom kromatografija?

Slalom kromatografija predstavlja rješenje u području razdvajanja većih nukleinskih kiselina. Može se koristiti u različite analitičke svrhe pri analizi nukleinskih kiselina, uzimajući u obzir njihov oblik, duljinu i tip nukleinske kiseline. Tijekom analize molekule se u koloni istežu i skupljaju uslijed nastanka kinetičkih sila, čime se omogućuje njihovo razdvajanje. Kod ove tehnike redoslijed eluacije suprotan je u odnosu na hidrodinamičku kromatografiju, odnosno veće DNK molekule zadržavaju se dulje u koloni u usporedbi s manjima. Slalom kromatografija dobila je naziv po olimpijskom sportu slalomu, u kojem skijaši vijugaju između prepreka.

U koloni molekule nukleinskih kiselina, tijekom kretanja od početka prema kraju kolone, prolaze pored prepreka i na taj način tvore tzv. „slalom“. Fleksibilnije molekule, poput jednolančane RNK, lakše i brže se kreću između prepreka te se stoga eluiraju prve. Suprotno tome, veće molekule, poput dvolančane RNK, imaju više poteškoća pri manevriranju između prepreka zbog svoje veličine, što ih usporava, pa eluiraju kasnije.

Kod slalom kromatografije važno je i to da molekule zadržavaju izdužen oblik unatoč visokim smičnim silama koje nastaju pri visokom tlaku i velikom protoku. Za slalom kromatografiju prikladne su dvolančane RNK i DNK molekule veće od 4 kbp.

Kretanje molekula u slalom koloni pod mikroskopom:

Slalom kromatografija: novi pristup i usporedba s gel-elektroforezom

Za razliku od gel-elektroforeze, gdje se razdvajanje temelji na kretanju nabijenih čestica kroz umreženi gel pod utjecajem električnog polja, slalom kromatografija temelji se na djelovanju kinetičkih sila.

Kako bismo usporedili učinkovitost slalom kromatografije i agarozne gelske elektroforeze, razmotrimo primjer usporedbe obje tehnike na ljestvici od 0,5 µg nukleinskih kiselina 23 kbp dsDNA, koja je sadržavala fragmente veličine 2; 2,3; 4,3; 6,5; 9,4 i 23 kbp, uz primjenu 1× TAE pufera, pri protoku od 1,30 mL/min, tlaku od 10.820 psi i temperaturi od 40 °C. Komponente uzorka praćene su na temelju njihove apsorbancije pri valnoj duljini od 260 nm.

Rezultati razdvajanja pojedinih dsDNA komponenti, zabilježeni na slalom koloni GTxResolve 250 Å (4,6 × 300 mm), uspoređeni su s rezultatima dobivenima agaroznom gelskom elektroforezom (slika 1).

Slalom kromatografijom uspješno razdvajamo nukleinske kiseline veće od 4 kbp u 3,5 minute

Dok su fragmenti dsDNA veličine < 4 kbp na agaroznem gelu dobro ločeni, je bila ločljivost večjih fragmentov (> > 4 kbp) bila je izrazito bolja na koloni GTxResolve 250 Å, pri čemu je uočen 4,5-puta veći porast rezolucije za fragmente u rasponu od 9,4 do 23 kbp. Ovi rezultati jasno potvrđuju prikladnost i primjenjivost slalom kromatografije za analizu velikih dsDNA molekula većih od 4 kbp. Također, vrijeme razdvajanja pri slalom kromatografiji znatno je kraće – 3,5 minute – u usporedbi s tradicionalnom elektroforezom, za koju je potrebno oko 60 minuta.

 

 

Agarozni gelovi često zahtijevaju dodatne korake optimizacije. Na primjer, preporučeni uvjeti od strane proizvođača možda neće dati očekivani broj profila. Kako bi se postigao optimalan i barem djelomično ponovljiv rezultat, često je potrebno prilagoditi udio agaroze, obradu uzorka i maseno opterećenje uzorkom. Uz to, pogreške pri pipetiranju uzrokuju da je ova tehnika više kvalitativna nego kvantitativna.

 

 

 

Slalom kromatografija, u usporedbi s tradicionalnim metodama poput gel-elektroforeze, omogućuje superiorno razdvajanje, rezoluciju i učinkovitost detekcije u vremenu kraćem od pet minuta za veće nukleinske kiseline (> 4 kbp). Priprema HPLC sustava pritom se bitno ne razlikuje od pripreme za druge tehnike tekućinske kromatografije.

Također, jedna od prednosti slalom kromatografije jest to što je za kvalitetno razdvajanje dovoljna već i mala količina uzorka, primjerice 10 ng.

Uvođenjem slalom kromatografije moguće je analizirati veće nukleinske kiseline primjenom najsuvremenije tehnike, uz „in-house“ znanje i povjerenje u ponovljive i visoko osjetljive rezultate koje pruža Waters oprema.

Robusne Slalom kolone – s prilagođenom stacionarnom fazom i metalnim kućištem

Budući da se u laboratorijskom radu nastoji što više smanjiti nepotrebne troškove, životni vijek kolone izuzetno je važan. Slalom kromatografija provodi se pri visokim tlakovima (npr. 10 750 psi), visokim protocima (npr. 1,3 mL/min) i povišenim temperaturama (40 °C). Kako su molekule pri nižim temperaturama viskoznije, može doći do porasta tlaka, zbog čega se preporučuje odgovarajuće podešavanje temperature u koloni. Zbog navedenih radnih uvjeta, stacionarna faza slalom kolona prilagođena je iznimnoj robusnosti, inertnosti, učinkovitosti, rezoluciji i ponovljivosti između pojedinih proizvodnih serija kolona.

Robusnost kolona GTxResolve 250 Å Slalom. a) Preklapanje vrhova 23K DNA ljestvice tijekom 400 injektiranja. b) Usporedba tlaka između 1. i 400. injektiranja pokazuje minimalne promjene.

Sigurnost zaposlenika pri analizi nukleinskih kiselina

Prednost slalom kromatografije jest u tome što za uspješnu analizu nije potrebna uporaba toksičnih reagensa poput etidij-bromida, akrilamida, fenola ili kloroforma, čime se značajno povećava sigurnost laboratorijskog osoblja.
Slalom kromatografija je brzo i vrlo osjetljivo UHPLC/UPLC rješenje za detekciju većih molekula nukleinskih kiselina i dsRNA kontaminanata u mRNA terapeuticima koji nastaju tijekom in vitro transkripcije. U usporedbi s agaroznom gelskom elektroforezom, slalom kromatografija omogućuje znatno bolje razdvajanje velikih nukleinskih kiselina (> 4 kbp), do 4,5 puta bolju rezoluciju većih dsDNA fragmenata, vrlo kratko vrijeme analize (≈ 3,5 min) umjesto ~60 min te visoku osjetljivost već pri 10 ng uzorka, uz istovremeno bolju ponovljivost i kvantitativnost. Metoda je robusna, slalom kolone imaju dug životni vijek, a sama tehnika je sigurnija za laboratorijsko osoblje jer ne zahtijeva upotrebu toksičnih reagensa poput etidijevog bromida, akrilamida, fenola ili kloroforma.

Autorica članka je Simona Ribizel, prodajna predstavnica tvrtke Labtim, koja se u svom radu fokusira na podršku laboratorijima pri odabiru i optimizaciji potrošnog materijala te rješavanje praktičnih izazova u analitičkim procesima.

IZVORI:

1. Retention mechanism in combined hydrodynamic and slalom chromatography for analyzing large nucleic acid biopolymers relevant to cell and gene therapies https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967324004497
2. Theoretical predictions to facilitate the method development in slalom chromatography for the separation of large DNA molecules https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967324007532
3. Gel elektroforeza
   http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/seminar-Parkelj.pdf
4. Gel Electrophoresis Safety
   https://www.safety.rochester.edu/
5. A New Alternative to Gel Electrophoresis: Higher Resolution and Faster Analysis of Large Nucleic Acids by Rigorously Designed GTxResolve^TM 250 Å Slalom Columns
   https://www.waters.com/nextgen/us/en/library/application-notes/2025/a-new-alternative-to-gel-electrophoresis-higher-resolution-and-faster-analysis-of-large-nucleic-acids-by-rigorously-designed-gtxresolve-250-slalom-columns.html
6. Rapid and Sensitive Detection of dsRNA Contaminants in mRNA Using the GTxResolve™ 250Å Slalom Chromatography Column
   https://www.waters.com/nextgen/us/en/library/application-notes/2025/rapid-and-sensitive-detection-of-dsrna-contaminants-in-mrna-using-the-gtxresolve-250a-slalom-chromatography-column.html

NAPOMENA: Sadržaj ovog članka namijenjen je općem informiranju i nema znanstveni ili istraživački karakter. Prije uvođenja bilo kakvih izmjena u radne postupke preporučuje se stručna procjena u suradnji s našim stručnim timom, u skladu sa specifičnim zahtjevima vašeg laboratorija.